揭開微生物基因組內部的神秘面紗

重點整理

• 這種方法使科學家能夠輕鬆研究微生物中的基因功能。

• 它可以應用於廣泛的孤立有機體，或分析來自混合多種物種的微生物組樣本的基因。

• 初步實驗已經顯示與人類健康相關的細菌功能，未來的研究也將探討生態系統中的功能。

洛倫斯伯克利國家實驗室（Berkeley Lab）開發的一種新技術，將使研究人員更容易發現微生物中未知功能基因所編碼的特徵或活動，這是理解各個物種角色和影響的關鍵一步。

這種名為條碼過表達細菌隨機文庫測序（Boba-seq）的方法，已於八月五日發表在《自然通訊》上。

「在微生物宇宙中有太多的基因暗物質——我們今天的方法能快速進行測序的DNA，但卻不知道其功能。問題是，我們該如何研究這些物質，以理解環繞我們的微生物組？基本的答案就是這樣，」主作者亞當·阿金（Adam Arkin）表示，他是伯克利實驗室生物科學領域的資深科學家。

Boba-seq涉及從感興趣的細菌中提取隨機DNA片段並在宿主細菌細胞中表達。「我們的想法是可以看到新基因的存在如何導致該細菌生長表型的變化，」首位作者、布法羅大學微生物學和免疫學助理教授黃耀蘭（Yolanda Huang）表示，她在研究進行時是阿金實驗室的博士後研究員。「這是一種功能基因組學的方法，我們可以用它迅速將基因或DNA片段與潛在功能聯繫起來。」

名稱中的「條碼」一詞指的是科學家用來作為更大DNA片段識別標籤的小DNA序列，類似於雜貨店中條碼用小代碼識別特定物品的方式。研究對象的整個基因組隨機分離成包含單個基因或多個基因簇的片段，然後插入已用獨特條碼標記的質粒（圓形DNA包）。Boba-seq「文庫」指的是包含來自某一生物的所有條碼質粒的集合。該文庫可以引入不同的細菌宿主，以生成大量的基因變體，然後對其進行篩查以發現新的行為或特性。

阿金和生物科學領域的同事們是高通量技術研究基因功能的領軍專家，並參與了多種其他技術的發明，這些技術可以插入或沉默基因以探究其功能，包括RB-TnSeq、CRISPRi和Dub-Seq。

利用Boba-seq，數十萬個條碼片段可以放入宿主細胞中並在不同條件下培養，以確定其功能。例如，若某些條碼的細胞在整個培養暴露於抗生素時生長良好，而其他細胞卻滅亡，那麼你就知道該片段中的基因編碼了抗生素抗性特徵。由於有條碼的幫助，識別這一新能力的相關片段變得便宜且迅速。

「耀蘭在Boba-seq方面的創新使我們能夠識別在數十萬個片段中，哪些片段賦予了我們所需的表型或特性，」阿金表示。「我們的新策略使我們能夠製作文庫，並以比以往的過表達方法更高的通量使用它們。」

另一個重要的突破是，Boba-seq片段可以在它們來源的同一生物體（或其近親）中進行測試，這對於準確了解基因的功能至關重要。以往的技術受到限制，因為它們僅在模型生物如大腸桿菌和酵母中測試基因。與大腸桿菌非常不同的生物的基因在大腸桿菌中往往無法正常功能，因此很難或不可能清楚了解這些基因的作用。

用於處理Boba-seq實驗室結果的計算工具已在開源平台上向其他研究人員開放。「我很高興看到世界各地的其他人如何使用Boba-seq，特別是在腸道或環境的宏基因組研究中，」合著者、阿金實驗室的加州大學伯克利分校研究生阿莉森·洪（Allison Hung）表示。「從微生物群落中提取功能信息而不需要孤立，能節省大量時間和資源，對於研究那些難以在實驗室中培養的微生物，如目前作為ENIGMA計劃的一部分研究的複雜生態系統中的微生物，至關重要。」ENIGMA，即生態系統和基因與分子組合的集成，是一個由阿金共同主導的能源部（DOE）科學重點領域，旨在了解微生物社群如何在生態系統中循環養分並去毒重金屬污染物。

在建立和完善Boba-seq後，阿金的團隊通過研究豐富於人類腸道且在內部微生物組中扮演多重角色的微生物分類群——擬桿菌目（Bacteroidales）——來測試這一新技術。擬桿菌目還是陸地土壤過程中的主要參與者，它們能降解有機物並將養分回饋給植物。研究團隊從六種擬桿菌目物種的文庫中生成了305,000個條碼片段，並平行評估了超過21,000個編碼蛋白質的基因。

這些原則驗證實驗的結果顯示，編碼某些脂質分子合成酶的基因賦予對頭孢克肟（ceftriaxone，一種頭孢類抗生素）的抗性。這些基因之前並未與抗生素抗性相關聯，因此值得進一步研究。

該團隊還發現了幾個新的碳水化合物代謝功能，包括一種需要代謝氨基糖（glucosamine）的酶，氨基糖是一種在骨骼、結締組織及昆蟲和甲殼類動物外骨骼中發現的改良糖分子。在腸道中，微生物使用氨基糖作為能量分子並構建其細胞壁，而形成腸道内襯的人的細胞則利用它生成粘液膜，這有助於維持健康的養分吸收並防止病原體入侵。

這些針對擬桿菌目的見解將幫助健康研究人員更好地理解腸道功能，因為這一分類群「大多數時間作為共生菌存在，並真正維護腸道健康，」黃表示。「但是在某些狀態下，擬桿菌釋放的養分可能被病原體用來促進它們自身的生長。」

阿金及其ENIGMA同事現在正在利用Boba-seq研究土壤微生物如何從環境中複雜的碳基分子中獲取能量，這些分子絕大多數生命形式無法代謝。同時，黃計劃在布法羅大學雅各布醫學與生物醫學科學院的新實驗室中使用Boba-seq研究細菌用來逃避細菌噬菌體（感染細菌的病毒）攻擊的基因、提高腸道的定植效率以及分解複雜碳水化合物的能力。

這項研究部分得到了能源部科學辦公室的支持。耀蘭·黃是生命科學研究基金會的Astellas製藥獎得主。

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洛倫斯伯克利國家實驗室（Berkeley Lab）致力於通過清潔能源、健康地球和發現科學的研究來為人類提供解決方案。該實驗室成立於1931年，基於團隊能最佳解決重大問題的信念，伯克利實驗室及其科學家已獲得16項諾貝爾獎。來自全球的研究人員依賴該實驗室的世界一流科學設施進行他們的開創性研究。伯克利實驗室是一個多計畫國家實驗室，由加利福尼亞大學管理，隸屬於美國能源部的科學辦公室。

美國能源部的科學辦公室是美國物理科學基礎研究的最大單一支持者，並致力於應對我們時代的一些最緊迫的挑戰。部分資料參考自美國能源部與美國NSO團隊。